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行業新聞

2020-07-23基於多組分含量測定和化學計量學的風寒感冒顆粒整體質量評價研

 要:目的  建立壹種超高效液相色譜(UHPLC-UV)波長切換法同時測定風寒感冒顆粒中D-苦杏仁苷、葛根素、橙皮苷等14種化學成分的含量,結合化學計量學分析不同來源樣品的質量差異。方法  色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18150 mm×2.1 mm2.7 μm),以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫,切換波長(210254310 nm)對5家生產企業68批樣品中14種化學成分含量進行測定;並使用雷達圖分析、相似度評價、熱圖聚類分析和主成分分析法對數據進行統計分析。結果  68批樣品中各成分質量分數分別為D-苦杏仁苷0.0633.885 mg/g3′-羥基葛根素0.0121.540 mg/g、葛根素0.0364.017 mg/g3′-甲氧基葛根素0.0161.837 mg/g、葛根素-6″-O-木糖苷0.0040.449 mg/g、芹糖葛根素苷0.0212.076 mg/g、大豆苷0.0101.527 mg/g、升麻素苷0.0070.471 mg/g5-O-甲基維斯阿米醇苷0.0621.029 mg/g、橙皮苷0.2108.453 mg/g、迷叠香酸0.0010.237 mg/g、水合氧化前胡素0.0070.204 mg/g、甘草酸0.0561.311 mg/g、氧化前胡素0.0020.042 mg/g。化學計量學分析表明,同壹廠家不同批次樣品的整體質量壹致性較好,但不同廠家之間樣品的整體質量壹致性存在較大差異。結論  建立的基於UHPLC波長切換法的多組分含量測定方法簡便、重復性好、專屬性強,可為風寒感冒顆粒的整體質量評控提供方法參考。
 

米奇7777狠狠狠狠视频風寒感冒顆粒源於經典名方麻黃湯,由麻黃、葛根、紫蘇葉、防風、桂枝、白芷、陳皮、苦杏仁、桔梗、甘草、幹姜11味中藥組方而成,具有解表發汗、疏風散寒的功效,用於治療風寒感冒身熱、頭痛、咳嗽等癥。該藥現行質控標準主要是《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第壹冊(標準中原名“風寒感冒沖劑”),標準的整體質控力較弱,僅有性狀、制劑通則檢查項[1],缺少薄層鑒別和含量測定等質控方法。風寒感冒顆粒的生產企業較多,不同廠家、不同批次之間的整體質量和壹致性評價至今尚無文獻報道。目前其質控研究主要集中在鹽酸麻黃堿、葛根素、橙皮苷、升麻素苷等1個或2個成分含量測定[2-4],檢測指標少,難以有效控制風寒感冒顆粒的整體質量。通過文獻調研,本研究選擇D-苦杏仁苷[5]、葛根素[6-8]、升麻素苷[9]、橙皮苷[10-11]、迷叠香酸[12]、甘草酸銨[13]14個主要藥味的特征化學成分作為指標,對風寒感冒顆粒的整體質量進行多組分化學評價。所選14個化學成分涵蓋方中苦杏仁、葛根、防風、陳皮、紫蘇葉、白芷、甘草7味藥材,且藥理活性與風寒感冒顆粒的臨床應用有直接關聯,這些化學成分的含量高低能在壹定程度上反映風寒感冒顆粒的整體質量情況。由於選擇的14個待測化學成分的最大吸收波長差異較大,不能在同壹波長下同時測定,為兼顧各化學成分的最大吸收波長,提高靈敏度,減少幹擾,本實驗采用UHPLC波長切換法對市場占有率較高的5家生產企業的68批次樣品進行含量測定,並進行化學計量學分析,以期能為風寒感冒顆粒的整體質量評控和標準修訂提供壹些參考。

米奇7777狠狠狠狠视频1  儀器與試藥

1.1  儀器

Thermo 3000超高效液相色譜儀,配備二極管陣列檢測器,美國賽默飛世爾科技公司;Thomovanquish UHPLC串聯Q Exactiveplus四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜,美國賽默飛世爾科技公司;XPE26百萬分之壹電子天平,瑞士Mettler Toledo公司;AE-240十萬分之壹電子天平,德國賽多利斯公司;SK250H超聲儀,50kHz,上海科導超聲儀器有限公司;10100 μL移液槍,德國Eppendorf公司;Milli-Q超純水制備系統,美國Millipore公司。

1.2  試藥

對照品葛根素(批號110752-201816,質量分數95.4%)、大豆苷(批號111738-201603,質量分數93.3%)、升麻素苷(批號111522-201712,質量分數96.2%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號111523-201811,質量分數97.4%)、迷叠香酸(批號111871-201706,質量分數90.5%)、甘草酸銨(批號110731-201720,質量分數97.7%)、橙皮苷(批號110721-201818,質量分數96.2%)、大豆苷元(批號111502-200402)由中國食品藥品檢定研究院提供;對照品D-苦杏仁苷(批號18032611,質量分數98.0%)由成都普菲德生物技術有限公司提供;對照品3′-羥基葛根素(批號MUST-19041601,質量分數99.59%)、3′-甲氧基葛根素(批號MUST-19041602,質量分數98.47%)、葛根素-6″-O-木糖苷(批號MUST-19052801,質量分數99.45%)、芹糖葛根素苷(批號MUST-19022203,質量分數99.41%)、水合氧化前胡素(批號MUST-19022202,質量分數99.95%)、氧化前胡素(批號MUST-19022201,質量分數98.04%)、川陳皮素(批號MUST-18042205,質量分數98.86%)由成都曼斯特生物科技有限公司提供。

色譜級甲醇、色譜級乙腈、質譜級甲酸,美國Fisher公司;色譜級磷酸,天津市科密歐化學試劑有限公司;分析純甲醇、乙醇等試劑購自廣東光華科技股份有限公司;水為超純水。

1.3  樣品

68批次風寒感冒顆粒樣品來自5個生產企業,信息見表1

 

 

2  方法與結果

2.1  色譜質譜條件

2.1.1  色譜條件 色譜柱為AgilentPoroshell 120 EC-C18150 mm×2.1mm2.7 μm);以乙腈(A0.1%磷酸水溶液(B)為流動相,梯度洗脫程序為032 min2%14% A3257 min14%18% A5780 min18%50% A;體積流量為0.3mL/min;柱溫為25 ℃;檢測波長:020 min254 nm2022 min210 nm2245 min254 nm4558 min210 nm5861 min330 nm6180 min254 nm;進樣量為5 μLUHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析過程以0.1%甲酸水溶液為流動相B,其余條件同上。

2.1.2  質譜條件 離子源為HESI-II源;離子傳輸管溫度320 ℃,輔助氣溫度350 ℃,輔助氣壓力10 arb,鞘氣壓力35 arb,噴霧電壓3.50 kV。掃描方式:正離子Full MS/dd-MS2模式,Full MS分辨率為70 000 FWHMdd-MS2分辨率為17 500 FWHM,質荷比窗口寬度為m/z 1,碰撞能梯度為204060 eV,掃描範圍為m/z1001 500

2.2  溶液的制備

2.2.1  混合對照品溶液的制備  D-苦杏仁苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素-6″- O-木糖苷、芹糖葛根素苷、大豆苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、迷叠香酸、水合氧化前胡素、甘草酸銨、氧化前胡素對照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成含D-苦杏仁苷429.1 μg/mL3′-羥基葛根素235.8 μg/mL、葛根素341.4 μg/mL3′-甲氧基葛根素154.6μg/mL、葛根素-6″-O-木糖苷51.5 μg/mL、芹糖葛根素苷218.3 μg/mL、大豆苷233.3 μg/mL、升麻素苷46.9 μg/mL5-O-甲基維斯阿米醇苷97.2 μg/mL、橙皮苷313.2 μg/mL、迷叠香酸28.5 μg/mL、水合氧化前胡素44.9 μg/mL、甘草酸銨293.1 μg/mL、氧化前胡素11.7 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2  供試品溶液的制備  取風寒感冒顆粒粉末4.0 g,精密稱定,置錐形瓶中,準確加入甲醇50 mL,稱定質量,超聲提取30min,放冷,再稱定質量,用甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,精密吸取續濾液5 mL,揮幹,殘渣用50%甲醇溶解,並轉移至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得。

2.3  方法學考察

2.3.1  線性範圍考察  精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液,稀釋制得系列不同質量濃度的混合對照品溶液。按照“2.1.1”項色譜條件依次進樣,記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標,化合物質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,進行線性回歸,結果見表2。結果表明,各成分在各自質量濃度範圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

2.3.2  精密度試驗  取“2.2.1”項下混合對照品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次,記錄峰面積,計算RSD。結果顯示,14種待測化學成分峰面積的RSD1.09%2.28%,表明儀器精密度良好。

2.3.3  穩定性試驗  取同壹供試品溶液(S1),分別在048121624 h進樣測定,記錄峰面積並計算RSD,結果顯示,14種待測化學成分峰面積的RSD0.30%2.81%,表明供試品溶液在制備後24h內基本穩定。

2.3.4  重復性試驗  取同壹批樣品(S1),按“2.2.2”項下方法,平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進行檢測,計算各成分含量。結果顯示,14種待測化學成分質量分數的RSD0.24%2.93%,表明該測定方法重復性良好。

2.3.5  加樣回收率試驗  精密稱取已知含量的樣品粉末(S19份,每份取樣量為供試品溶液制備時取樣量的50%,以當前取樣含量的0.51.01.5倍,分別精密加入混合對照品溶液,按“2.2.2”項方法制備供試品溶液,按含量測定方法測定,計算加樣回收率。結果顯示,14種待測化學成分的平均加樣回收率為95.24%100.00%RSD1.18%2.92%。表明該方法具有良好的準確度,方法可行。

2.4  樣品含量測定

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進樣5 μL分析,計算各成分含量。典型的色譜圖見圖1,含量測定結果見表3

 

為了更直觀地反映各生產企業樣品中化學成分的含量分布情況,繪制了14種化學成分的平均含量分布情況雷達圖。由於不同化學成分的含量差異較大,將5個生產企業樣品中14種化學成分含量平均值分別進行加和,再以各生產企業每種化學成分的含量平均值與相應總和比較,得到比值,用比值繪制雷達圖,結果見圖2。結果顯示,各化學成分含量比值的落點幾乎沒有重合,而且落點分布廣,表明同壹化學成分在不同企業樣品中的差異較大。企業A的整體輪廓較大,說明該企業樣品中14種化學成分含量均較高,提示質量可能較好;而企業E的整體輪廓明顯小於其他企業,說明該企業樣品中14種化學成分含量均偏低,提示從多組分化學含量高低的角度來評價該企業樣品質量可能不佳。以D-苦杏仁苷為例,D-苦杏仁苷為苦杏仁中平喘止咳的主要活性成分[5],企業A樣品中的平均含量是企業E樣品中平均含量的28.5倍(3.591 mg/g vs 0.126 mg/g),且5個不同生產企業樣品中D-苦杏仁苷的含量差異較大,這是值得關註的。
2.5  化學計量學統計分析

2.5.1  指紋圖譜相似度評價及特征圖譜的構建  指紋圖譜能更全面地反映中成藥中各種化學成分的整體分布情況,尤其是在現階段有效成分絕大多數尚不明確的情況下[14-15]。將68批不同生產企業風寒感冒顆粒UHPLC-UV圖譜,導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》,與參照譜圖(整體色譜豐度較高的ABCD 4家生產企業樣品UHPLC-UV圖譜生成)比較相似度,相似度分析結果見表4。結果顯示,ABCD 4家生產企業的風寒感冒顆粒樣品相似度大於0.940,表明這些批次樣品間的整體差異性較小;而企業E樣品相似度在0.8560.983,表明與其他企業相比,企業E的樣品整體質量差異較大。但含量測定結果表明,不同生產企業的樣品之間14個化學成分的含量存在壹定差異,經查閱文獻報道[16-17],可能是不同樣品指紋圖譜沒有色譜峰缺失和增加,僅存在峰面積大小差異,而不同化學成分峰面積差異較大,高達數百倍,大峰掩蓋小峰信息所致。

含量測定結果表明不同生產企業風寒感冒顆粒化學成分含量差異較大,整體質量評控難度大。因此在多成分含量測定的基礎上,進壹步建立了風寒感冒顆粒的特征指紋圖譜,以期為風寒感冒顆粒質量的整體評控提供參考。將整體色譜豐度較高的46批次(不含E廠家22批次)風寒感冒顆粒的UHPLC- UV譜圖數據,導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》,以S1為參照譜圖(在46批次樣品的色譜圖中峰度相對較高),經多點校正後,進行色譜峰的匹配,生成特征指紋圖譜。采用對照品比對和UHPLC-Q-Exactive- Orbitrap HRMS技術對25個共有峰進行指認,其中16個色譜峰經對照品比對確證,6個色譜峰經過高分辨質譜指認,構建的典型風寒感冒顆粒特征指紋圖譜見圖3。經高分辨質譜分析但未經對照品比對色譜峰離子碎片信息見表5

2.5.2  熱圖聚類分析  為了更直觀地展示不同企業生產的風寒感冒顆粒的多組分化學差異性,以測得的68批次樣品中14種化學成分的含量作為評價指標,采用HemI-1.0軟件以歐氏距離、遠鄰法進行熱圖聚類分析,結果見圖4。其中橫向聚類樣品,縱向聚類成分含量,熱圖顏色條帶的變化體現各成分的含量高低。熱圖分析結果顯示不同生產企業中14種化學成分的含量差異較大。其中生產企業A各成分條帶顏色偏暖,表明其所含各成分含量均較高,其產品質量較好;而生產企業E各成分條帶顏色均偏冷,表明其所含各成分含量均較低,其產品質量較差,與雷達圖分析結果壹致。不同生產企業聚類分析結果顯示68批次樣品總體聚類區分較明顯,各企業樣品各自聚為壹類,表明同壹生產企業的樣品質量壹致性較好而不同生產企業的樣品間的質量壹致性較差。成分聚類結果顯示C3C10聚為壹類,C1單獨聚為壹類,其他成分聚為壹類,表明C1D-苦杏仁苷)、C3(葛根素)、C10(橙皮苷)為區分各樣品的主要成分。

2.5.3  主成分分析(principal component analysisPCA PCA可對復雜信息中的多變量進行快速提取、降維分析,通過降維可排除眾多化學信息中相互重疊的信息,生成新的綜合變量即主成分,經投影處理後,樣本最終落在主成分組成平面上的位置,即可表征不同樣本的總體信息[23-25]。本研究以68批次風寒感冒顆粒中14種化學成分含量為變量,采用多元變量統計軟件 SIMCA 14.1進行PCA。分析結果顯示,貢獻率最大的3個主成分,累積方差貢獻率超過90%,表明前3個主成分能夠充分體現出風寒感冒顆粒的基本特征和主要信息。模型R2X0.963Q20.911,表明模型擬合效果較好,結果見圖56

由圖5可知,各生產企業樣品出現明顯的分類,PCA的整體區分與熱圖聚類分析結果壹致;企業B樣品分布相對較分散,提示其不同批次之間的質量存在壹定的差異。圖6主成分載荷圖,表示每個化學成分對主成分綜合作用的貢獻,每1個點代表1個化學成分,距離載荷圖原點越遠的變量,權重越大,代表該化合物的含量對樣本區分起的作用就越大。載荷圖中橙皮苷(C10)、D-苦杏仁苷(C1)在坐標系中的絕對值較大,表明這2個成分是區分不同生產企業風寒感冒顆粒的重要指標,與熱圖聚類分析結果壹致。橙皮苷是陳皮的指標性成分,具有增強毛細血管韌性、縮短出血時間等藥理活性[10-11];目前,市場流通環節的陳皮來源混雜,茶枝柑、大紅袍、朱橘、溫州蜜桔、福橘等數十個柑橘品種或品系的成熟果皮均作陳皮使用,且產地、加工方式、儲藏時間等不同,導致藥材中橙皮苷含量差異顯著,提示生產企業應關註陳皮投料藥材的質量壹致性。D-苦杏仁苷是苦杏仁止咳平喘的主要活性成分,易異構化為L-苦杏仁苷,且在壹定的溫度和濕度條件下易被水解為葡萄糖、氫氰酸和苯甲醛,導致D-苦杏仁苷含量差異較大,提示生產企業應關註苦杏仁投料的原藥材質量及提取工藝對D-苦杏仁苷的影響。

3  討論

課題組前期到生產企業實地調研,發現不同生產企業用於投料的原藥材來源、大生產過程中的工藝參數(如加水量、揮發油提取方式及提取時間、制成總量)、生產設備等存在較大差異。本實驗研究結果表明,同壹企業不同批次樣品的整體質量壹致性(化學壹致性)相對較好,但不同企業之間樣品的整體質量壹致性差異較大,這值得監管部門和企業的關註。

中成藥化學成分復雜,僅僅測定少數幾個指標性成分很難全面反映中成藥的整體質量差異,多組分化學表征有利於其整體質量評控。通過文獻調研,本研究建立了風寒感冒顆粒處方中7味藥味14種化學成分的同時定量分析方法,以評價風寒感冒顆粒整體質量。課題組曾嘗試同時測定君藥麻黃的指標性成分鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿,但由於化學性質差異較大,分離度及峰型較差,不能滿足測定條件,故采用水蒸氣蒸餾法對其進行單獨測定。測定結果顯示5家不同生產企業的風寒感冒顆粒中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿總量均值規律為C0.545 mg/g)>A0.519 mg/g)>B0.436 mg/g)>D0.211 mg/g)>E0.100 mg/g),生產企業E二者總量僅為生產企業C18.34%

本實驗建立了基於UHPLC波長切換法的風寒感冒顆粒中14種化學成分的同時定量分析方法,並對市場流通環節收集的5個生產企業的68批樣品進行測定,具較強的代表性和較廣的覆蓋面。通過雷達圖、指紋圖譜相似度評價、熱圖聚類分析和PCA等化學計量學綜合評價了不同生產企業樣品的整體質量情況,為風寒感冒顆粒的質量評控提供了客觀數據和參考方法。

參考文獻(略) 

來  源: 許  莉,黃曉婧,高  鵬,趙小勤,文永盛,譚  鵬.基於多組分含量測定和化學計量學的風寒感冒顆粒整體質量評價研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(14):3670-3679.

 

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